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MLPA

 

 

  MLPA(Multiples ligation-dependent probe amplification),多重连接依赖探针扩增,是一种在同一反应管内检测多达50个核苷酸序列的拷贝数变化的方法。MLPA可以快速同时鉴定几十个基因的缺失和插入,可用于血液,肿瘤样本的DNA,mRNA的表达谱分析。而且,MLPA方法可用于甲基化分析。MLPA已经证实是可信而可靠的方法,目前已广泛应用于全世界900多个实验室,使用该技术发表的论文已近千篇。

  技术原理

  MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交,之后通过连接、PCR扩增,产物通过毛细管电泳分离及数据收集,分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段,两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异。只有当连接反应完成,才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰。如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变,那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加,因此,根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。

 

 

  技术平台

 

 

  技术优点

  1.仅通过选用不同探针即可以检测多种疾病

  2.为多重反应,一个反应可提供近50个靶位点。

  3.反应费用较低。

  4.重复性好,简单易操作,可以同时检测多个样本。

  5.敏感性高,仅需20 ng 人DNA,结果不受样品DNA量的影响。

  6.能区分单个碱基的差异,能检测少量的拷贝数改变,如2个,3个拷贝数改变。

  7.可以检测单一外显子的缺失和插入突变。

  应用领域

  1.检测小的重排:BRCA1,BRCA2,MSH2等。

  2.检测大范围的染色体重排:williams syndrome,prader-willi/angelman syndrome等。

  3.检测亚端粒区的拷贝数改变。

  4.检测染色体非整倍体改变,(包括羊水样本)。

  5.肿瘤诊断:ALL,CLL,Oligodendrogliomas,melanomas,neuroblastomas等病的拷贝数改变。

  6.甲基化定量检测:Parader-willi、angelman syndrome, Fragile X等。

  7.mRNA分析细胞凋亡和炎症反应。

  部分MLPA试剂盒举例

 

 

  样本要求

 

样本类型

具体要求

冷冻组织

获得新鲜的组织样本后,立即置于液氮中快速冷冻。液氮冷冻半小时后,保存于-80°C冰箱,干冰运输。

石蜡包埋组织

每个样本需要8~10片石蜡片,每片厚4-5 μm。请提供HE染片。常温保存,常温运输。

细胞沉淀

收获培养的细胞后,离心去除培养液,PBS洗2次,立即置液氮中快速冷冻。液氮冷冻半小时后,保存于-80°C冰箱,干冰运输。

外周血

抗凝剂:可用枸橼酸钠或EDTA,不建议用肝素。外周血总量:≥2 mL。样本直接保存于-80°C 冰箱,干冰运输。

基因组DNA

TE溶解;提供Nano Drop结果;总量≥2 μg DNA (提取自新鲜及冻存样本),总量≥3 μg DNA (提取自FFPE样本);纯度OD260/280在1.7-1.9之间;浓度≥20 ng/μL。DNA完整无降解,无RNA、蛋白质等污染。

 

  检测周期

  7个工作日